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逆轉錄實驗操作重點干貨分享
點擊次數(shù):94 更新時間:2024-11-25

       逆轉錄(reverse transcription)是以 RNA 為模板合成 DNA 的過程,即 RNA 指導下的 DNA 合成,逆轉錄實驗包括3大要素,分別是引物、逆轉錄酶和 RNA 模板:

1. 引物:逆轉錄引物主要有3種,包括 Oligo(dT)、Random Primers 和基因特異性引物(GSP)。其中 Oligo(dT)具有12-20個 T 堿基,并且與真核生物 mRNA 的 3’Poly A 尾配對,可合成全長的 cDNA,但僅擴增有 polyA 尾的 mRNA ,對模板質量要求高,較適合克隆實驗。而 Random Primers 具有6-9個堿基,可隨機識別模板并結合,適合復雜結構和微量模板,但特異性低,小片段多,適合后續(xù) qPCR 實驗?;蛱禺愋砸锟梢宰R別特定模板序列,具有特異性強,靈敏度高的特點,但需合成特定的序列。所以根據(jù)不同實驗需求可進行相應引物的選擇。

2. 逆轉錄酶:一種是來自純化的禽成髓細胞瘤病毒(AMV),由兩條肽鏈組成,具有聚合酶活性和很強的 RNaseH 活性,它最適溫度是42℃,最適 pH8.3,在高反應溫度時可消除 mRNA 的二級結構對逆轉錄的阻礙,然而高水平的 RNaseH 的活性既抑制 cDNA 產(chǎn)生也限制其長度。另一種來源于鼠白血病病毒(M-MLV),是單肽鏈的,有 RNA 聚合酶活性和相對較弱的 RNaseH 活性,最適溫度37℃,最適 pH7.6,較弱的  RNaseH 活性對獲得2-3kb的 mRNA 的全長 cDNA 有很大好處。

3. RNA 模板:通常利用紫外分光光度計檢測純度,要求A260/280=1.9~2.1,A260/230=2.0~2.2。利用瓊脂糖凝膠電泳檢測 RNA 的完整度,完整的總 RNA 在進行瓊脂糖凝膠電泳時會產(chǎn)生清晰的28S 和18S rRNA 條帶(真核樣品),28S rRNA  條帶的強度應當大致為18S rRNA 條帶的兩倍,并且無 gDNA 和蛋白殘留。

        上面給大家簡單介紹了一下逆轉錄的3大要素,除此之外在實際的操作過程中,還會有各種各樣的讓問題我們措手不及,下面給大家一一詳細解答!

1. 如何提高 RT-PCR 反應的靈敏度與特異性?

① 確定模板 RNA 完整性好,無 DNA 污染。

② RNA 模板中不應含有擴增反應抑制劑。

③ 使用適量的模板 RNA ,模板量太多會降低特異性,太少會導致擴增不出條帶或條帶太弱。

④ 若模板中有二級結構,可通過提高逆轉錄反應溫度來提高擴增效果。

2.  RNA 中含有逆轉錄抑制劑時,怎么處理?

逆轉錄抑制劑包括:SDS 、EDTA 、甘油、焦磷酸鈉、亞精胺和胍鹽等等??蓪⒁汛_定的高質量 RNA 模板同樣品混合,同高質量 RNA 模板比較產(chǎn)量以檢測 RNA 抑制劑;若高質量模板 RNA 與樣品混合后產(chǎn)量降低,則說明樣品中存在逆轉錄抑制劑,可用70%(v/v)乙醇對 RNA 沉淀進行清洗,以除去抑制劑。

3. 逆轉錄后的 qPCR 實驗 Ct 值偏大或者普通 PCR 產(chǎn)量低。

① RNA 模板質量差,需要重新制備 RNA 模板,可通過瓊脂糖凝膠電泳檢測質量。

② 逆轉錄后的 cDNA 中含有高濃度的模板 RNA 和逆轉錄試劑成分,可能會對后續(xù)的PCR 產(chǎn)生抑制作用,所以可以適當梯度提高 cDNA 稀釋比例(通常來說可將 cDNA 原液稀釋5-10倍,其最佳模板加入量以擴增得到的 Ct 值在20-30個循環(huán)為好)。

③ 起始的 RNA 模板量低,需要減少稀釋倍數(shù)或增加 RNA 模板量。

④ 基因本身原因(復雜和長度),可以重新設計復雜基因的引物,避免復雜結構?;蛘哂萌椒ǔ绦蚧蜓娱L兩步法程序的延伸時間。

⑤ 逆轉錄或者定量產(chǎn)品性能差,可以通過做平行不用品牌產(chǎn)品對比實驗,對比逆轉錄產(chǎn)品性能。

4. 逆轉錄酶擴增效率評估,應該關注哪些指標?

建議: qPCR-ct 值,或者 PCR 產(chǎn)量

如果想比較逆轉錄性能,最為直接的還是后續(xù)做 qPCR 或者 PCR 平行對比實驗,這種方法相對較為準確。

不建議:cDNA 中間產(chǎn)物濃度測定 or 其他方法。

逆轉錄完成后是不建議測定產(chǎn)物濃度的,由于逆轉錄后產(chǎn)生 RNA-cDNA 雜交鏈,溶液中的 RNA 和部分 DNA 會對吸光值產(chǎn)生影響,所以測定出來的產(chǎn)物濃度并不準確,即使利用同一批次 RNA 和不同品牌的試劑盒進行對比實驗,由于不同品牌之間的逆轉錄體系具有或多或少的差異,其體系中的各種離子等都能對吸光度產(chǎn)生影響,所以測定的結果也沒有可比性。

優(yōu)化及注意事項:

① 逆轉錄 PCR 時,提取 RNA 是關鍵,需分離高質量 RNA(純度和完整性)。

② 整個操作過程需使用去 RNA 酶的槍頭、EP 管等耗材。

③ 逆轉錄過程中要謹防 RNA 酶的污染,加入 RNA 酶抑制劑。

④ 為了防止非特異性擴增,必須設陰性對照。

⑤ 逆轉錄實驗應全程在冰上操作完成,操作過程應避免 RNase 污染。

⑥ 提高逆轉錄預熱溫度(也可根據(jù)相應逆轉錄試劑盒進行調整)。

⑦ 減少基因組 DNA 污染,可使用去基因組的逆轉錄試劑盒。


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